Seurat 是单细胞RNA数据分析的一个特田主流的R包，升级到面前V5版块后，会带来一些不友好的地点，关联词也有一些功能上的升级，大家一定凭据我方的情况和分析需求来笃定是否升级。V5的升级部分主要体当今以下4个方面（https://satijalab.org/seurat/articles/get_started_v5_new），本次先先容第一个：Seurat V5中去批次程序的集成。

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Seurat v5引入了愈加生动和精简的基础架构，不错用一瞥代码完成不同的集成去批次算法，极大的减少了不同程序的环境准备和数据处理时代，不错更聚焦在使用哪种程序抑止更好。这使得探索不同集成程序的抑止变得愈加容易，并将这些抑止与摒除集成程序的责任流进行比拟。本文以ifnb数据集手脚示例，展示去批次的经过和程序。

一 R包，数据准备 

上期奖号和值为97，最近十期和值分别为116 105 118 106 100 103 84 137 64 97，最近十期和值分布在64-137之间。综合分析本期预计红球和值出现在123左右。

上期龙头开出奇数号码05，近10期龙头奇数号码开出7次，偶数号码开出3次，本期优先考虑奇数号码，龙头参考05。

1 载入R包下载关连的R包，防范当今径直install.packages('Seurat')默许安设的即是V5版块。

library(Seurat)library(SeuratData)#remotes::install_github("satijalab/seurat-wrappers")remotes::install_local("./seurat-wrappers-master.zip",upgrade = F,dependencies = F)library(SeuratWrappers)library(ggplot2)library(patchwork)options(future.globals.maxSize = 1e9)

该系列会有较多的R包是在github中，可能存在无法安设的问题。以satijalab/seurat-wrappers为例，当github的包无法下载时候，不错找到github地址然后点击Code，下载zip文献，

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然后使用remotes::install_local的模样 腹地安设。2 下载示例数据测试数据集相似在外网，受限于上网模样和网速，也大略率会报错。无法下载的不错尝试下载到腹地然后再安设（http://seurat.nygenome.org/src/contrib/ifnb.SeuratData_3.1.0.tar.gz），更无数据集的称呼以及下载涌现参考https://zhuanlan.zhihu.com/p/661800023https://zhuanlan.zhihu.com/p/661800023 。

# 下载测试数据集#InstallData("ifnb")install.packages('./ifnb.SeuratData_3.1.0.tar.gz', repos = NULL, type = "source")

下载后载入数据，然后稽查待处理的批次情况（stim列）

# load in the pbmc systematic comparative analysis datasetobj <- LoadData("ifnb")obj <- UpdateSeuratObject(obj)obj <- subset(obj, nFeature_RNA > 1000)objAn object of class Seurat 14053 features across 1254 samples within 1 assay Active assay: RNA (14053 features, 0 variable features) 2 layers present: counts, data

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不错看到Seurat V5一个很大的变化即是layer。

二 数据整合（批次处理） 

app1，数据拆分示例的Seurat对象中包含2种不同处理的数据(meta的stim列)，软件开发公司使用Seurat v5 整合时是拆分为不同的layer 而无需拆分为多个对象。不错看到拆分后出现4个layer (stim列中的每个批次王人有我方的count和data矩阵)。Seurat V4 需要将数据拆分为2个不同的Seurat对象。

obj[["RNA"]] <- split(obj[["RNA"]], f = obj$stim)objAn object of class Seurat 14053 features across 1254 samples within 1 assay Active assay: RNA (14053 features, 0 variable features) 4 layers present: counts.CTRL, counts.STIM, data.CTRL, data.STIM

请防范，由于数据被分红几层，因此对每一批次稀薄现实归一化和HVG 。(自动识别一组一致的变量特征)。

obj <- NormalizeData(obj)obj <- FindVariableFeatures(obj)obj <- ScaleData(obj)obj <- RunPCA(obj)

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这里会针对每个“batch”分别进行NormalizeData 和 FindVariableFeatures。2 数据径直归拢（不去批次）先尝试径直归拢的模样，稽查数据的批次情况

#径直整合obj <- FindNeighbors(obj, dims = 1:30, reduction = "pca")obj <- FindClusters(obj, resolution = 2, cluster.name = "unintegrated_clusters")obj <- RunUMAP(obj, dims = 1:30,                reduction = "pca",                reduction.name = "umap.unintegrated")DimPlot(obj, reduction = "umap.unintegrated",         group.by = c("stim", "seurat_annotations"))

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3，一瞥代码去批次Seurat v5中的integratelayer函数补助一瞥代码完成去批次集因素析，面前补助以下五种主流的单细胞集成去批次程序。Anchor-based CCA integration (method=CCAIntegration)Anchor-based RPCA integration (method=RPCAIntegration)Harmony (method=HarmonyIntegration)FastMNN (method= FastMNNIntegration)scVI (method=scVIIntegration)

#CCAobj <- IntegrateLayers(  object = obj, method = CCAIntegration,  orig.reduction = "pca", new.reduction = "integrated.cca",  verbose = FALSE)#RPCAobj <- IntegrateLayers(  object = obj, method = RPCAIntegration,  orig.reduction = "pca", new.reduction = "integrated.rpca",  verbose = FALSE)#Harmonyobj <- IntegrateLayers(  object = obj, method = HarmonyIntegration,  orig.reduction = "pca", new.reduction = "harmony",  verbose = FALSE)#FastMNNobj <- IntegrateLayers(  object = obj, method = FastMNNIntegration,  new.reduction = "integrated.mnn",  verbose = FALSE)obj

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可见新加多了4种去批次程序，底下即是程序可视化，然后罗致最终的程序络续后续分析。还要防范界说new.reduction的名字，否则会被遮掩掉。4，笃定去批次程序4.1 ，umap展示这里用CCA 和 RPCA 示例，其他的两种相似的模样，防范修改reduction.name 。

#####CCA######obj <- FindNeighbors(obj, reduction = "integrated.cca", dims = 1:30)obj <- FindClusters(obj, resolution = 2, cluster.name = "cca_clusters")obj <- RunUMAP(obj, reduction = "integrated.cca",                dims = 1:30,                reduction.name = "umap.cca")p1 <- DimPlot(  obj,  reduction = "umap.cca",  group.by = c("Method", "CellType", "cca_clusters"),  combine = FALSE, label.size = 2)#####RPCA######obj <- FindNeighbors(obj, reduction = "integrated.rpca", dims = 1:30)obj <- FindClusters(obj, resolution = 2, cluster.name = "rpca_clusters")obj <- RunUMAP(obj, reduction = "integrated.rpca",                dims = 1:30,                reduction.name = "umap.rpca")p2 <- DimPlot(  obj,  reduction = "umap.rpca",  group.by = c("Method", "CellType", "rpca_clusters"),  combine = FALSE, label.size = 2)wrap_plots(c(p1, p2), ncol = 2, byrow = F)

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对比径直归拢，不错看到不同stim之间的批次效应被整合，不错加上另两种同期展示4种程序，当今一种进行后续的分析。4.2 Marker 可视化还不错诈欺经典marker比拟不同去批次程序的进展（1）VlnPlot 图

p1 <- VlnPlot(  obj,  features = "rna_CD8A", group.by = "unintegrated_clusters") +   NoLegend() + ggtitle("CD8A - Unintegrated Clusters")p2 <- VlnPlot(  obj, "rna_CD8A",  group.by = "cca_clusters") +   NoLegend() + ggtitle("CD8A - CCA Clusters")p3 <- VlnPlot(  obj, "rna_CD8A",  group.by = "rpca_clusters") +   NoLegend() + ggtitle("CD8A - RPCA Clusters")p1 | p2 | p3

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（2）DimPlot 图

p4 <- DimPlot(obj, reduction = "umap.unintegrated", group.by = c("cca_clusters"))p5 <- DimPlot(obj, reduction = "umap.rpca", group.by = c("cca_clusters"))p6 <- DimPlot(obj, reduction = "umap.cca", group.by = c("cca_clusters"))p4 | p5 | p6

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凭据以上的信息笃定最终使用的去批次程序。

三 FindMarker 分析 

笃定去批次程序后，就不错进行FindMarker 以及谛视。1，rejoin layer要防范面前的layer是凭据stim批次拆分开的，在进行任何的differential expression analysis之前王人要先使用JoinLayers函数进行rejoin the layers  。

objobj2 <- JoinLayers(obj) #仅为了辞别，内容情况下使用obj即可obj2

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接下来即是DEG分析，找到各个cluster的marekr基因进行手动谛视或者径直使用singleR等自动谛视软件完成谛视。参考资料：https://satijalab.org/seurat/articles/seurat5_integrationhttps://satijalab.org/seurat/articles/integration_introduction

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